A maioria do cortisol plasmático está ligada a proteínas e aproximadamente 1% é secretado intacto na urina. O cortisol urinário pode ser medido através da realização de um procedimento de extração, que remove alguns dos metabolitos solúveis na água antes da análise, ou através da análise direta da urina. Os imunoensaios medem o cortisol na urina e alguns metabolitos imunoativos. A medição de cortisol na urina reflete a quantidade de cortisol sérico não ligado (ou livre) e constitui um auxílio no diagnóstico da hiperatividade suprarrenal. Um nível elevado de cortisol na urina é considerado um fator de diagnóstico da síndrome de Cushing.
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